Bitkilerde DNA İzalasyonu

Bitkide DNA İzolasyonu

Biyoteknoloji çalışmalarında DNA izolasyonu oldukça önemli bir basamaktadır. Bitkilerin genetik ilişkilerinin tespit edildiği moleküler karajterizasyon çalışmalarında, genetik haritaların oluşturulmasında, GDO’ların tespit edilmesi için yapılan çalışmalarda, mutasyon belirleme ve markırlar yardımı ile yapılan erken seleksiyon gibi çalışmalarda bitkisel dokulardan DNA izolasyonu gerçekleştirilmelidir.

Uygulama kapsamında, bitkisel materyallerden DNA izolasyonunu gerçekleştirmek amacıyla yapraklar toplanmıştır. Her örnek porselen havan içerisinde sıvı azot ile öğütülerek 0,1 g olacak şekilde 1,5 ml’lik santrifüj tüplerine alınmıştır (Şekil 1).

Şekil 1. A.Yaprakların Sıvı Azota Daldırılması, B. Yaprakların Sıvı Azotta Öğütülmesi, C. Örneğin Santrifüj Tüplerine Doldurulması, D. Sıvı Azottaki Santrifüj Tüplerinin Saklama İçin Alınması

DNA İzolasyonu İçin Gerekli Solüsyonların Hazırlanması

Uygulamada MiniPrep DNA izolasyon yöntemi kullanılmıştır (Johnstone ve Thompson, 1991). DNA izolasyonu aşamasında kullanılan tampon çözeltinin içeriği Çizelge 1’de sunulmuştur. İzolasyon sırasında ekstraksiyon tampon çözeltiler dışında kloroform:izoamilalkol (24:1 oranında), Tris-EDTA (Tris 1 M pH:8, EDTA: 0.5 M pH:8), RNase A (10 mg/ml) solüsyonu, izopropanol ve etil alkol (%99) kullanılmıştır.

Çizelge 1. DNA izolasyon yönteminde kullanılan tampon çözeltisinin içeriği

Solüsyon Konsantrasyon
CTAB %2.00
NaCl (5 M) 1.4 M
EDTA (0,5 M) pH 8,0 0.2 M
TRIS-HCl (1 M) pH 8,0 0.1 M

DNA İzolasyon Aşamaları; (Şekil 2.)

Ø      Hazırlanmış olan ekstraksiyon solüsyonundan her tüpe 396µl ve 4µl β-merkaptoetanol eklenmiştir.

Ø      Bir pipet aracılığıyla tüpler homojenlik sağlanana kadar karıştırılmış ve daha sonra tüpler 65oC’de 20 dakika bekletilmiştir ve iki defa karıştırılmıştır.

Ø      Her tüpe 400µl kloroform:izoamilalkol eklenerek 15 dakika vorteks yardımıyla karıştırılmıştır.

Ø      Tüpler 5 dakika 13.000 rpm/dk santrifüj edilmiştir. Bekleme sırasında her örnek için yeni temiz bir santrifüj tüpü hazırlanıp etiketlenmiştir ve tüplerin içine 400 µl soğuk (-20oC) izopropanol eklenmiştir.

Ø      Santrifüj tamamlandığında tüplerin üst kısmındaki sıvı kısım steril pipet aracılığıyla 400 mikrolitre soğuk (-20oC) izopropanol içeren santrifüj tüplerine aktarılmıştır. Tüpler dikkatli bir şekilde karıştırılarak 1 saat süreyle –20oC’de bekletilmiştir.

Ø      5 dakika 13.000 rpm/dk santrifüj edilmiştir.

Ø      Süpernatant dikkatli bir şekilde dökülmüştür. Pelletin kuruması için tüpler ters bırakılarak bekletilmiştir

Ø      Kuruyan Pellet 100 µl TE (Tris-EDTA) içerisinde çözülmüştür. Her tüpe 4 µl RNase A eklenmiştir ve 15 dakika oda sıcaklığında tüpler bekletilmiştir.

Ø      Her tüpe 500 µl soğuk EtOH (%100) (buzluktan çıkmış) eklenmiştir ve tüpler dikkatli bir şekilde karıştırılarak 1 saat süreyle –20oC’de bekletilmiştir.

Ø      5 dakika 13.000 devirde santrifüj edilmiştir.

Ø      Süpernatant dikkatli bir şekilde dökülmüş ve pelletin kuruması için tüpler ters çevrilmiştir

Ø      Pellet 100 µl TE (Tris-EDTA) içerisinde çözülmüştür.

Ø      Örnekler –20oC’de saklanmıştır.

Şekil 2. A. Öğütülmüş bitkisel materyalin 65o C’de bekletilmesi, B-C. Tüplerin üzerine solüsyonların eklenmesi, D. Santrifüj işlemi.

Ar. Gör. Özhan Şimşek
Çukurova Üniversitesi
Ziraat Fakültesi
Bahçe Bitkileri Bölümü

You may also like...

3 Responses

  1. Hakan YAZAR dedi ki:

    Özhan Hocam’a çok teşekkür ederim. İyi bir çalışma oldu bizler açısından.

  2. ozhansimsek dedi ki:

    Faydalı olduysa ne mutlu bana, daha güzel çalışmalar yaparız inş daha vaktimiz var

  3. sevinc dedi ki:

    Merhaba,
    Ben Moleküler ıslah ta çok iyi yetiştirildim.Stajımı Akdeniz üni.Tohum araştırma ve geliştirme merkezinde yaptım.DNA -RNA çıkartmada yada izlenen tüm bu yolları çok iyi biliyorum fakat bu alanla ilgili iş bulamadım .:(yardımcı olursanız sevınırm

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak.

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.